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O aparecimento de Helicase Induzido por ATP Revela Subunidades altamente Coordenadas Citações Citações 36 Referências Referências 30 Primeiro considerado como uma possível peculiaridade da UvrD, mas de fato todas as helicases estudadas até agora em condições de molécula única apresentam comportamento similar, as únicas exceções são as enzimas hexaméricas que cercam Uma única vertente de DNA e, portanto, não pode trocar os fios 38. Análise de molécula única também revelou que as helicases podem perder o controle sobre o ssDNA em que se movem levando a um deslizamento ou movimento rápido para trás 39. O comportamento de comutação da cadeia de helicases é compatível com Um mecanismo de inch-worm: a estrutura da helicase envolve dois domínios RecA articulados com um domínio de dobradiça. Questões gerais Resumo Resumo Resumo Resumo: Helicases é uma ampla família de enzimas que desempenham funções cruciais na replicação de DNA e na manutenção da integridade de DNA e RNA. Um estudo mecânico detalhado de helicases em DNA e RNA é possível usando métodos de manipulação de moléculas únicas. Entre elas, as pinças magnéticas (ou armadilhas) apresentam um ensaio de processamento conveniente e moderado (dezenas de enzimas podem ser monitoradas simultaneamente) que permitem estudos de alta resolução (par único base) dessas enzimas em várias condições e em vários substratos (duplo e DNA e RNA de cadeia simples). Aqui discutimos várias implementações do ensaio básico relevante para esses estudos. Artigo Jun 2017 quotT7 helicase se move em DNA através de hidrólise de nucleotídeos sequencial e mecanismo de translocação, onde cada subunidade do anel leva a ligação no nucleótido entrante (Liao et al. 2005 Crampton et al., 2006 Enemark e Joshua-Tor, 2006 Thomsen e Berger , 2009 Patel et al., 2017). Portanto, em qualquer momento, apenas a subunidade líder da helicase T7 liga um dTTP entrante e carretéis na base de nucleotídeos da junção fork (Sun et al., 2017). Existem três etapas mínimas durante cada evento de desenrolamento de pares de bases. Quot Mostrar resumo Ocultar resumo RESUMO: a replicação de DNA eLife digest é o processo pelo qual uma molécula de DNA é copiada para formar duas moléculas idênticas. Primeiro, uma enzima chamada helicase de DNA separa os dois fios da dupla hélice do DNA. Isso forma uma estrutura chamada um garfo de replicação que possui duas cadeias simples expostas. Outras enzimas chamadas DNA polimerases, em seguida, usam cada cadeia como um modelo para construir uma nova cadeia de DNA correspondente. As polimerases de DNA criam as novas cadeias de DNA juntando moléculas menores chamadas nucleotídeos. Uma das novas vertentes de DNA chamou os principais modelos firmados de forma contínua, enquanto o outro ficou paralisado por uma série de pequenos fragmentos que mais tarde se uniram. Construir a cadeia principal exige que a helicase e a polimerase de DNA trabalhem em conjunto. No entanto, não ficou claro como essas duas enzimas coordenam sua atividade. Agora, Nandakumar et al. Estudaram a helicase e a DNA polimerase de um vírus que infecta bactérias e identificou as posições exatas das enzimas em um garfo de replicação. Os experimentos revelaram que tanto a polimerase quanto a helicase contribuem para a separação das cadeias de DNA e que esse processo é mais eficiente quando a helicase é apenas um único nucleótido antes da polimerase. Outras experiências mostraram que a helicase estimula a polimerase ajudando-a a se ligar a nucleótidos e que a polimerase estimula a helicase, ajudando-a a separar as cadeias de DNA a um ritmo mais rápido. O próximo desafio é investigar a configuração molecular que permite que a helicase e a polimerase aumentem as atividades de cada um deles. DOI: dx. doi. org10.7554eLife.06562.002 Texto completo Artigo Maio 2017 Divya Nandakumar Manjula Pandey Smita S Patel No segundo tipo de experiência de mapeamento, T7 gp4 foi paralisado na junção da forquilha com o análogo dTTP não hidrolisável, dTMPPCP. T7 gp4 não se transloca na presença de dTMPPCP e liga DNA com nM K d e tempo de vida de horas (Hingorani e Patel, 1996 Kim et al. 2002 Sun et al., 2017). A polimerase foi então caminhou em direção à helicase paralisada por extensão de iniciador que foi iniciada 16 nucleótidos a montante da junção fork (Figura 5A). Resumo: Ao medir simultaneamente a síntese de DNA e a hidrólise de dNTP, mostramos que a polimerase de DNA T7 e a helicase T7 gp4 se movem em sincronia durante a síntese de cadeia principal, tomando passos de um nucleotídeo e hidrolizando um dNTP por par de bases descompactado. A catálise cooperativa permite que a helicase e a polimerase se movam a uma velocidade uniformemente rápida sem guanina: dependência de citosina (GC) ou inativa com hidrólise de NTP fútil. Mostramos que a helicase e a polimerase estão localizadas perto da junção da forca de replicação. Esta arquitetura permite que a polimerase use sua síntese de deslocamento de fio para aumentar a taxa de desenrolamento, enquanto que a helicase ajuda esse processo por translocação ao longo do DNA de cadeia simples e aprisionando as bases desenroladas. Assim, em contraste com o modelo de desenrolamento exclusivo da helicase, nossos resultados sugerem um modelo em que a helicase e a polimerase estão se movendo em passos de um nucleotídeo, a síntese de DNA desenha o desenrolar do garfo e um papel da helicase é capturar as bases desenroladas e Prevenir o reanálise de DNA. Artigo de texto completo Mar 2017 Manjula Pandey Smita S PatelAA (Departamento de Física - Laboratório de Física Atômica e de Estado Sólido, Universidade de Cornell, Ithaca, Nova Iorque, 14853, EUA), AB (Departamento de Física - Laboratório de Física Atômica e de Estado Sólido, Universidade de Cornell, Ithaca, Nova Iorque 14853, EUA), AC (Departamento de Bioquímica, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, Nova Jersey 08854, EUA), AD (Departamento de Física - Laboratório de Física Atômica e de Estado Sólido de Cornell Universidade, Ithaca, Nova Iorque 14853, EUA), AE (Departamento de Bioquímica, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, Nova Jersey 08854, EUA), AF (Departamento de Bioquímica, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, New Jersey 08854, EUA), AG (Departamento de Física - Laboratório de Física Atômica e de Estado Sólido, Universidade de Cornell, Ithaca, Nova Iorque, 14853, EUA) Nature, Volume 478, Issue 7367, pp. 132-135 (2017). (Homepage da natureza) (c) 2017: Nature Publishing Group, uma divisão da Macmillan Publishers Limited. Todos os direitos reservados. Helicases são enzimas vitais que realizam a separação de fios de ácidos nucleicos duplex durante a replicação, reparo e recombinação. O produto do gene T7 do bacteriófago é uma helicase hexameira modelo que foi observada para usar dTTP, mas não ATP, para desenrolar o DNA de cadeia dupla (ds) enquanto se transloca de 5 a 3 ao longo do DNA de cadeia simples (ss). Se e como diferentes subunidades da helicase coordenam suas atividades quimio-mecânicas e a ligação do DNA durante a translocação ainda estão em debate. Aqui abordamos essa questão usando uma abordagem de uma única molécula para monitorar o desenrolamento da helicase. Descobrimos que a helicase T7, de fato, desenrola dsDNA na presença de ATP e que a taxa de desenrolamento é ainda mais rápida do que a dTTP. No entanto, os traços de desenrolamento mostraram um padrão de dente de serra notável em que o desenrolado processual foi interrompido repetidamente por eventos repentinos de deslizamento, impedindo o desenrolar sobre uma distância substancial. Este comportamento não foi observado com dTTP sozinho e foi bastante reduzido quando a solução de ATP foi suplementada com uma pequena quantidade de dTTP. Essas descobertas apresentaram a oportunidade de usar misturas de nucleotídeos para investigar a coordenação da subunidade da helicase. Descobrimos que a helicase T7 liga e hidrolisa ATP e dTTP por cinética competitiva de tal forma que a taxa de desenrolamento é ditada simplesmente pelas suas respectivas taxas máximas V max. Constantes de Michaelis K M e concentrações. Em contraste, a processividade não segue um comportamento competitivo simples e mostra uma dependência cooperativa das concentrações de nucleotídeos. Isso não concorda com um mecanismo não coordenado em que cada subunidade funciona de forma independente, mas suporta um modelo em que quase todas as subunidades coordenam suas atividades quimio-mecânicas e a ligação do DNA. Nossos dados indicam que apenas uma subunidade de cada vez pode aceitar um nucleótido enquanto outras subunidades são ligadas a nucleótidos e, portanto, interagem com o DNA para assegurar a processividade. Essa coordenação da subunidade pode ser geral para muitas helicases em forma de anel e revela um mecanismo potencial para a regulação do desenrolamento de DNA durante a replicação.